Mikromacierze oligonukleinowe
Jak już we wstępie zostało wspomniane macierze oligonukleinowe są to takie, w których DNA umieszczone na płytce ma na ogół 25-70 nukleotydowe sekwencje. Ten rodzaj macierzy jest produkowany przez firmę Affymetrix, a których zdjęcie jest umieszczone poniżej (zdjecie pobrane z www.wikipedia.org):
Sercem 'Gene Chip'a' jest kwarcowa płytka mająca wymiary 5x5 cali i jest pokryta światłoczułym związkiem chemicznym zapobiegającym przyklejaniu się cząstek.Ten rodzaj macierzy charakteryzuje się tym, że wybiera się odpowiednie sekwencje oligonukleinowe, hybrydyzujące jedynie do sekwencji danego gatunku i przyczepia się je w poszczególnych polach płytki(zazwyczaj której powierzchnia jest wykonana z dwutlenku krzemu), poprzez syntezę sekwencji zasady po zasadzie– ich układ zależy od genomu badanego organizmu. Sama płytka jest wykonywana za pomocą techniki fotolitografii, czyli do płytki zostają przygotowywane odpowiednie łączniki chemiczne, do których następnie są wiązane sekwencje. Zabezpiecza się te łączniki światłoczułymi grupami chemicznymi, dzięki którym można zaprogramować płytkę na odpowiednią sekwencję. Czyli weźmy na przykład taka czystą płytkę i nanieśmy na nią jakiś roztwór mającym jeden dany typ nukleotydu – roztwór pokryje całą powierzchnię ale reakcja wiązania nie zachodzi – dopiero gdy zostaną naświetlone odpowiednie miejsca, w nich zaistnieje reakcja wiązania nukleotydu z łącznikiem. Następnie spłukuje się ten typ roztworu i nanosi kolejny, naświetlając znowu odpowiednio wybrane miejsca. Proces ten trochę przypomina budowanie wież z klocków z nadzorem osoby mówiącej jaki teraz kolor ma być postawiony. W tej metodzie może wystąpić nieoczekiwana hybrydyzacja krzyżowa dla genów o zbliżonych sekwencjach, zwłaszcza gdy we wprowadzanej próbce jest dużo materiału o krótkich sekwencjach. W celu wykrycia takich hybrydyzacji, dla każdego genu przygotowuje się kilka zestawów materiału oligonukleinowego, który jest nanoszony na kilka tak samo przygotowanych macierzy. Ekspresja genu w danej próbce jest analizowana i szacowana tylko gdy hybrydyzacja wystąpiła w prawie wszystkich przypadkach.
Przygotowanie próbki dla mikromacierzy oligonukleinowych.
Aby przygotować próbkę, którą będziemy nanosić na płytki, potrzebujemy ekstrahować roztwór z danej próbki tkankowej. Ale taki próbka zawiera dużą liczbę różnorodnych cząsteczek mRNA, których składu nie jesteśmy w stanie określić. Dlatego musimy oznakować poszczególne cząsteczki, a robi się to za pomocą kilku reakcji biochemicznych, które mają na celu zsyntetyzowanie cząsteczek RNA z biotyną. W tak przygotowanym roztworze zanurza się płytkę na kilka godzin, podczas których zachodzi hybrydyzacja RNA z oligomerami DNA płytki. Następnie wyciąga się płytkę i opłukuje z roztworu, co powoduje wymycie tych sekwencji, które nie uległy hybrydyzacji. RNA związane z biotyną ma silne powinowactwo do streptawidyny, a co za tym idzie – wprowadzając cząsteczkę streptawidyny fluorescencyjnej na płytkę, zostanie ona związana w miejscach występowania biotyny, czyli w tych obszarach płytki, w których nastąpiła hybrydyzacja RNA. Jest to poziom nanoszenia znacznika fluorescencyjnego, dzięki któremu teraz można wyznaczyć poziom fluorescencji poszczególnych pól na płytce za pomocą technik mikroskopii optycznej.
Celem końcowej analizy jest porównanie poziomów mRNA genów w różnych warunkach eksperymentalnych w kilku przedziałach czasowych lub też dla kilku różnych populacji komórek, za pomocą porównywania bezwzględnych intensywności fluorescencji na odpowiadających sobie polach na płytkach zawierających kolejne próbki biologiczne.